快速檢測飼料中有害微生物的方法與設備

　　當前，飼料安全問題已成為全球關注的重要議題，而有害微生物污染也成為飼料安全中的一項主要控制指標。飼料廠有害微生物主要有有害細菌、霉菌、大腸菌群等，它們對飼養(yǎng)動物和動物源性食品危害很大。飼料生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中普遍存在有害物質(zhì)，包括有害微生物的交叉污染。要控制飼料原料、產(chǎn)品中有害微生物，首先必須要有能夠準確快速的有害微生物撿測方法。經(jīng)典的標準檢測方法往往比較費時，所以有害微生物快速檢測方法成為近年來的研究熱點。本文根據(jù)近年來國內(nèi)外已發(fā)表的研究文獻，總結有害微生物快速檢測方法的研究進展，供參考。

　　1 飼料中有害微生物快速檢測方法研究進展

　　1.1 生物傳感器技術

　　生物傳感器(biosensor)是指對生物物質(zhì)敏感并能將其濃度轉換為電信號進行檢測的儀器;生物傳感器又分為：酶生物傳感器、微生物傳感器和免疫傳感器。它們具有成本低、體積小、靈敏度較高的優(yōu)點;能從腐敗或者半腐敗的食品、飼料中得到實時而快速、多樣化的分析檢測結果。

　　張杰等利用生物素——親和素系統(tǒng)將分子馬達與探針連接構建了F0F1——ATPase分子馬達生物傳感器，它能對副溶血性弧菌特異性識別，最低檢測限為1pg/反應體系，對其致病性進行快速診斷，無需熱循環(huán)反應，檢測周期縮短，整個分析過程只需1h——2h，不需酶切及電泳等繁瑣操作。

　　張捷等通過生物素——親和素系統(tǒng)將特異性沙門氏菌特異性基因(invA，作為其目的基因片段)核酸探針連接在F0F1——ATPase的ε亞基上構建生物傳感器;將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結合后，比較其催化三磷酸腺苷(ATP)合成30min后的ATP產(chǎn)生量，依此對樣品中的沙門氏菌DNA進行檢測。該方法對沙門氏菌DNA的檢測時間為1h，檢出限為10ng/ml。從分析樣本分離得到的30株細菌，利用分子馬達生物傳感器的檢測結果與PCR 檢測的結果一致。

　　Kim等為了提高傳感器對單增李斯特菌的分析檢測能力，設計了與實時的分析系統(tǒng)相連結的IMC模塊(immuno——magnetic concentration)。生物傳感器技術大大縮短了檢測時間，可在數(shù)小時甚至數(shù)分鐘內(nèi)查出致病微生物，為微生物的快速檢測提供了一種有效的工具。但該法在預處理方面受到某些限制。

　　1.2 基因芯片技術

　　基因芯片技術是在生命科學領域迅速發(fā)展的新型食源性檢測技術。該法把微電子光刻技術與DNA化學合成技術相結合，大大提高了基因芯片的探針密度，且試劑用量減少，可以實現(xiàn)標準化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有很大的發(fā)展?jié)摿?。將基因芯片技術與其它技術結合起來，能達到更好的效果。

　　戈海澤等根據(jù)生物信息學技術以細菌16SrDNA和23SrDNA序列設計各細菌的特異型探針和引物，在基因芯片制備基礎上，通過對靶基因的擴增、雜交和對雜交結果的分析，對常見腸道致病菌的檢測和鑒定效果進行評價，同時對臨床采集100份腹瀉患者糞便標本進行細菌培養(yǎng)。在100份臨床糞便標本中，采用基因芯片技術共檢出50份(50%)攜帶腸道致病菌;細菌培養(yǎng)鑒定出47份(47%)攜帶腸道致病菌，其中42份基因芯片與細菌培養(yǎng)結果一致，準確率為79.25%，與細菌培養(yǎng)結果比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。該該法具有高通量、高準確性和高靈敏度，檢測時間短，可同時檢測多種有害微生物，可以作為臨床鑒定細菌的一個重要的方法。將廣泛應用于食品飼料安全控制，突發(fā)性食品安全事件檢測，出入境檢驗檢疫等，但檢測費用昂貴。

　　1.3 聚合酶鏈式反應技術

　　聚合酶鏈式反應(PCR)是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速和對標本的純度要求低等優(yōu)勢;不過檢測樣品較多時工作量大。在食品安全越來越嚴峻的形式下，許多科技工作者試圖多種檢測方法聯(lián)用，達到解決上述問題的目的。將多種檢測方法聯(lián)用，旨在彌補單一檢測方法的局限性。目前國際上研究的熱點有多重熒光實時PCR檢測技術，兼具多重PCR和熒光實時PCR技術的實時定量檢測監(jiān)控PCR產(chǎn)物兩方面的優(yōu)點。

　　石建玲等根據(jù)幽門螺桿菌23SrDNA序列設計引物和探針，構建質(zhì)粒標準品，建立實時熒光定量PCR體系并進行方法學評價，對2012——05——10收集的100份臨床樣本進行檢測并同時應用免疫組化及銀染方法進行比較分析發(fā)現(xiàn)：檢測范圍寬，在107copies/l——102copies/l(指1l溶液里面DNA/RNA的拷貝數(shù)是多少個)內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系，且相關系數(shù)為1;與多種細菌均無交叉反應，特異性好;檢測時間短，整個PCR反應過程僅需70min;并可在不同拷貝數(shù)的標準品批內(nèi)重復測定，對臨床其它消化道病原體不出現(xiàn)特異性的擴增曲線;實時熒光定量PCR具有靈敏度和特異性高及重復性好等優(yōu)點。國外也有將酶聯(lián)免疫吸附測定與PCR技術聯(lián)用建立有害微生物檢測方法的報道，有效的提高了有害微生物的檢出率。

　　1.4 生物阻抗法

　　生物阻抗法的原理是利用由微生物新陳代謝引起的培養(yǎng)基電學特性變化快速檢出樣品中微生物的含量。阻抗法具有能區(qū)分活細胞和死細胞的優(yōu)勢，而死細胞常常無致病性，保障食品與飼料安全的關鍵就是檢驗活細胞的數(shù)量。陳江利用阻抗法檢測啤酒有害乳酸菌，630A培養(yǎng)基(奧地利SY——LAB公司)較適合于阻抗法，用E值作為阻抗值變化的判斷標準，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基法檢測結果相比，阻抗法的檢測結果準確可靠，能夠將檢測時間縮短至72h。此法檢測速度很快，但只能確定污染程度。

　　1.5 蛋白質(zhì)芯片技術

　　蛋白質(zhì)芯片技術又稱蛋白質(zhì)(微)陣列，是指將已知的大量蛋白質(zhì)(如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等)固定在經(jīng)化學修飾的固相載體(璃片、硅片等)上，在保留蛋白質(zhì)物化性質(zhì)的基礎上，蛋白質(zhì)與載體表面結合，再用激光掃描系統(tǒng)或者電感耦合器件獲取相關圖像;然后用專門的計算機軟件分析圖像、定性定量結果。Howell等采用俗稱軟蝕刻的微接觸印刷技術(microcontact printing，CP)制作出了一種可以檢測大腸桿菌E。coli O157∶H7及鮭腎桿菌(renibacterium salmoninarum)的抗體微陣列，結果表明：此芯片與其他有害微生物的交叉反應少， 檢出濃度為7×107cfu/ml，檢測時間是40min，是一種很有效的微生物檢測方法。

　　方珍建立了檢測E。coli O157∶H7的液相蛋白芯片方法。通過繪制檢測曲線，分別應用該方法及H2O作溶解劑的液相芯片方法檢測實際牛肉樣品。比較該方法與細菌分離培養(yǎng)法的陽性檢出率，能檢出陽性的最低濃度為103cfu/ml(?菌后)，最低檢出限為100cfu/ml;與18種腸道菌無交叉反應，特異性良好;3次重復實驗，批間變異系數(shù)7.61，重復性良好;應用該方法檢測牛肉樣品中人工添加細菌，能檢出陽性的最低濃度為0.5cfu/ml(增菌前);應用該方法檢測154份實際牛肉樣品，檢出陽性樣品19份，而細菌培養(yǎng)法檢出陽性樣品16份。蛋白質(zhì)芯片技術是一種高特異性、高靈敏度、高通量、重復性好、應用性強、適用范圍廣且微型化的分析技術，在生命科學的各個研究領域有很好的發(fā)展前景，但同基因芯片技術一樣，檢測費用高，發(fā)展還不成熟。

　　1.6 納米金標記技術

　　納米金標記技術是指直徑在1nm——100nm金的微小顆粒，具有高電子密度，介電特性和催化作用，可以與多種生物大分子結合，且不影響生物大分子的生物活性。近年來，基于納米金標記的快速檢測研究在有害微生物方面應用比較多，檢測的微生物種類也比較多，國內(nèi)外科技工作者通過對納米金顆粒表面特性的處理以及在納米金顆粒表面標記上特定的寡核苷酸探針，開發(fā)研究出了新的微生物檢測系統(tǒng)。

　　劉霞利用氨基偶聯(lián)法在傳感器表面固定多克隆抗體(PAb)作為一抗，金納米粒子(AuNPs)標記的大腸桿菌E。coli O157∶H7的多克隆抗體(PAb)作為二抗，通過三明治方法用雙通道表面等離子體共振(SPR)傳感器對E。coli O157∶H7進行檢測。SPR直接法檢出限為103cfu/ml，線性范圍為103cfu/ml——109cfu/ml;金納米粒子增強三明治法的檢出限為10cfu/ml，線性范圍為10cfu/ml——1010cfu/ml，靈敏度提高100倍，檢測范圍更寬，檢測時間縮短，選擇性和重現(xiàn)性較好。此技術具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、價廉、樣品所需量少等優(yōu)點，適合現(xiàn)場篩選，在飼料檢測中有著廣泛的應用價值和發(fā)展前景。

　　2 飼料中有害微生物快速檢測設備

　　目前，生物學領域的專家通過對微生物快速檢測方面深入的研究，開發(fā)了一系列技術，有ATP熒光儀、多功能微生物熒光檢測儀、微生物實時光電檢測系統(tǒng)、紙片法。這些用于食品中有害微生物的快速檢測技術，未來同樣可以在飼料中應用，這些方法的應用將為飼料安全提供有力的保障，同時可以促進我國飼料工業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。下面重點介紹常用的兩種有害微生物快速檢測設備。

　　2.1 RVLM 型微生物快速檢測系統(tǒng)

　　由德國皇家生物科技公司生產(chǎn)的高性能便攜式微生物檢測儀將多種檢驗方法的優(yōu)點集合應用，如培養(yǎng)皿法、酶法(β——葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜尋)、基因法(基因搜尋)，具有便捷、操作簡單、檢驗迅速、高靈敏性、高特異性、消耗成本低、定性半定量測量等諸多優(yōu)點。

　　2.1.1 快速檢測對象

　　活菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、腸道桿菌科、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌、霉菌(曲霉屬真菌、曲霉菌)、酵母菌、軍團菌等，可以定量檢測。

　　2.1.2 快速檢測產(chǎn)品特點

　　應用范圍廣：應用于食品、飼料、藥品、水質(zhì)、空氣微生物檢測等眾多領域，可檢測固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)及膏狀、漿狀等多種樣本。

　　使用方便：一套便攜系統(tǒng)即可完成采樣、實驗、后處理等工作，無需配備多種檢測儀器。

　　操作簡單：檢測樣本只需1ml或1g，且無需前處理，只需3個步驟就可完成操作。

　　高靈敏度：可檢測到數(shù)量級為1cfu的目標微生物，滿足國內(nèi)國際微生物檢測標準。

　　高特異性：特異性高達99.999%，杜絕非目標微生物造成的實驗干擾。

　　準確度高：可100%定量分析。

　　檢測數(shù)量：8個插槽可同時提供8項不同實驗，13類不同標準培養(yǎng)環(huán)境。

　　快速檢測：最快10min即可得到檢測結果，可用于現(xiàn)場檢測。

　　高智能化：能夠自動控制孵育溫度和孵育時間，并可自動生成實驗報告。

　　全自動化：獨立、持續(xù)地檢測并記錄瓶中的微生物數(shù)量(cfu)。

　　在歐洲的實驗室中，80%——90%的微生物檢測實驗采用的儀器是RVLM 型微生物檢測系統(tǒng)，其超高的靈敏度可以滿足歐盟及國內(nèi)檢測標準。RVLM型微生物快速檢測是目前業(yè)內(nèi)最高端的智能優(yōu)質(zhì)微生物檢測儀。

　　2.2 ChemScan RDI微生物快速檢測儀

　　ChemScan AES Chemunex公司將激光掃描合成成像技術與活細胞熒光酶標記相結合，研制成功ChemScan RDI微生物快速檢測儀。該儀器可在1.5h內(nèi)對可過濾樣品中的微生物及原生蟲進行快速計數(shù)，適于食品、飼料、化妝品及藥品行業(yè)。其特點：只檢測活細胞數(shù)，激光對整張濾膜掃描后自動讀數(shù)，速度極快，無需增菌，可在90min——100min內(nèi)出結果;可選配熒光顯微鏡與儀器連接，自動定位對可疑微生物進行確認觀察。靈敏度：可檢測出1個微生物或原生蟲;檢測范圍：1個——5000個細胞。